Trương Định sinh tại làng Tư Cung, phủ Bình Sơn, Quảng Ngãi (nay là xã Tịnh Khê, huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi). Cha ông là Lãnh binh Trương Cầm, từng là Hữu thủy Vệ uý ở Gia Định dưới thời vua Thiệu Trị.

Năm 1844, Trương Định theo cha vào Nam và kết hôn với bà Lê Thị Thưởng, vốn là con gái của một hào phú ở huyện Tân Hòa (Gò Công Đông ngày nay). Năm 1854, nhờ sự trợ giúp của bên vợ, Trương Định xuất tiền ra chiêu mộ dân nghèo lập đồn điền Gia Thuận (Gò Công), vì thế, ông được nhà Nguyễn phong chức Phó quản cơ. Bản tiểu sử Trương Định hiện treo tại đền thờ ông ở Gò Công ghi (trích):

Thời Tự Đức, Trương Định chiêu mộ dân nghèo, khai hoang, lập đồn điền ở Tân Hòa, được bổ làm Quản cơ. Tướng mạo ông khôi ngô, giỏi võ nghệ, thông binh thư, thi đậu cử nhân võ. Ông từng giữ chức Chánh quản cơ chỉ huy 6 liên đội, phòng giữ Đại đồn Chí Hòa chống Pháp...
Sự nghiệp

Tháng 2 năm 1859, quân Pháp đánh chiếm thành Gia Định, ông đem nghĩa binh lên đóng ở Thuận Kiều chống trả và đã từng thắng nhiều trận ở Cây Mai, Thị Nghè...

Quốc sử triều Nguyễn chép:

Trương Định...mộ binh dõng đông lắm, thường cự đánh binh Pháp. Việc ấy tâu lên, Ngài [vua Tự Đức] cho thăng Quản cơ, rồi lại cho lãnh Phó lãnh binh [1].
Đầu năm 1861, Pháp tấn công Gia Định lần thứ hai, Trương Định đem quân đồn điền của mình phối hợp với binh của tướng Nguyễn Tri Phương phòng giữ chiến tuyến Chí Hòa. Khi Đại đồn Chí Hòa thất thủ, ông lui về Gò Công, cùng Lưu Tiến Thiện, Lê Quang Quyền chiêu binh ứng nghĩa, trấn giữ vùng Gia Định-Định Tường.

Ở đây, Trương Định tổ chức lại lực lượng, triển khai tác chiến trong các vùng Gò Công, Tân An, Mỹ Tho, Chợ Lớn, Sài Gòn, Đồng Tháp Mười và kéo dài đến tận biên giới Campuchia.

Đầu năm 1862 Pháp chiếm Biên Hòa, Trương Định đứng lên mộ nghĩa, người hưởng ứng theo hơn vạn người[2].

Ngày 5 tháng 6 năm 1862, triều đình nhà Nguyễn ký kết hòa ước với Pháp. Cũng theo sử nhà Nguyễn thì:

Tháng 7 năm 1862...từ khi đã định hòa ước rồi, Ngài [Tự Đức] truyền dụ Nam Kỳ nghỉ binh và đòi Trương Định ra Phú Yên. Khi ấy trong các tỉnh Gia Định, Định Tường, Biên Hòa những người ứng nghĩa rủ nhau đoàn kết, tôn Trương Định làm Đại đầu mục, xin cho ra đánh, Đình thần nghị rằng: "bây giờ việc Bắc Kỳ đương khẩn, mà Nam Kỳ chưa có cơ hội gì, xin giao Phan Thanh Giản hiểu dụ". Nhưng Trương Định đã lâu mà không chịu về cung chức, bị cách chức hàm.
Trên thực tế, ông đã từ chối thư dụ hàng của tướng Pháp là Bonard, bất chấp chiếu vua ra lệnh bãi binh do Phan Thanh Giản truyền vào và rút quân về Gò Công, được nhân dân tôn là Bình Tây Đại Nguyên Soái, lấy nơi này làm bản doanh, xây dựng các căn cứ địa kháng chiến.

Ngày 16 tháng 12 năm 1862, Trương Định đã ra lệnh tấn công các vị trí của quân Pháp ở cả ba tỉnh miền Đông Nam Bộ, đẩy Pháp vào tình thế lúng túng, bị động. Tháng 2 năm 1863, nhờ có viện binh, Pháp phản công tại Biên Hòa, Chợ Lớn, bao vây Gò Công. Ngày 26 tháng 2 năm 1863, Pháp đánh chiếm thành trì, ông thoát khỏi vòng vây và kéo quân về Biên Hòa.

Tháng 9 năm 1863, tướng Lagrandière sang thay Bonard, mở cuộc càn quét thứ hai, bắt được vợ con và một số tùy tùng của Trương Định.

Ngày 19 tháng 8 năm 1864 , Huỳnh Công Tấn phản bội dẫn đường cho quân Pháp bất ngờ bao vây đánh úp. Bản doanh " Đám lá tối trời[3]thất thủ, Trương Định bị trọng thương (gãy xương sống)[4] và ông đã rút gươm tự sát tại Ao Dinh (Gò Công), để bảo toàn khí tiết vào sáng ngày 20 tháng 8 năm 1864, tức ngày 18 tháng 7 năm Giáp Tý.

Hay tin ông tuẫn tiết, vua Tự Đức bèn truy tặng ông phẩm hàm và cho lập đền thờ tại Quảng Ngãi.

Con ông là Trương Quyền đã rút lên vùng Châu Đốc tiếp tục chống Pháp thêm 6 năm nữa.

Hay tin Trương Định hy sinh, nhà thơ Nguyễn Đình Chiểu đã làm 12 bài thơ và một bài văn tế điếu ông. Trích giới thiệu một bài:

Trong Nam, tên họ nổi như cồn
Mấy trận Gò Công nức tiếng đồn
Đấu đạn hỡi rêm tàu bạch quỉ
Hơi gươm thêm rạng vẻ huỳnh môn
Ngọn cờ ứng nghĩa trời chưa bẻ
Quả ấn Bình Tây đất vội chôn
Nỡ khiến anh hùng rơi giọt luỵ
Lâm dâm ba chữ điếu linh hồn.
Tuyên bố
Tuyên bố của Trương Định trong thư trả lời thư dụ hàng của tướng Pháp Bonard vào cuối năm 1862:

“Triều đình Huế không nhìn nhận chúng ta, nhưng chúng ta cứ bảo vệ Tổ quốc chúng ta.”
Tuyên bố của Trương Định gửi các quan ở Vĩnh Long, để tỏ ý ly khai với Nam triều (vì sau hòa ước Nhâm Tuất, vua Tự Đức ra lệnh ông phải bãi binh) vào tháng 2 năm 1863:

“Muốn trở lại y như xưa, dân chúng ba tỉnh yêu cầu chúng tôi đứng đầu khởi nghĩa, chúng tôi không thể làm gì được khác. Chúng tôi chuẩn bị chiến đấu vào hướng Đông cũng như hướng Tây, chúng tôi chống đối và chiến đấu. Chúng tôi sẽ đánh ngã bọn giặc cướp...”
“Chúng ta thề sẽ đánh mãi và đánh không ngừng, khi ta thiếu tất cả sẽ bẻ nhánh cây làm cờ, lấy gậy gộc làm võ khí cho quân lính ta... ”
Hịch của Trương Định (tháng 8 năm 1864):

“Lòng dân đã muốn ta lên làm nguyên nhung ba tỉnh, ta trông vào lòng dân yêu thương không phai lạt của mọi người đối với ta. Thế là xong bất dung tha giặc cướp. ”
Mấy đoạn trích trên, được ghi trang trọng tại đền thờ Trương Định, ở ngay trung tâm Gò Công.